實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蛋白質(zhì)純化彌補(bǔ)了小規(guī)模探索性蛋白質(zhì)純化與高通量操作（如工業(yè)規(guī)模制造）之間的差距。在規(guī)模較大的一端，上游加工的進(jìn)步，例如改進(jìn)的發(fā)酵能力，導(dǎo)致可用于投入的原油樣品量增加。盡管這意味著目標(biāo)蛋白質(zhì)的潛在產(chǎn)量更高，但它也對(duì)下游的及時(shí)和成本有效的樣品處理提出了巨大的挑戰(zhàn)。由于雜質(zhì)含量較高導(dǎo)致規(guī)模增加，這一挑戰(zhàn)變得更加困難 - 這是由于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)和細(xì)胞密度增加所致。

通常，在**初的探索性蛋白質(zhì)純化階段進(jìn)行了許多優(yōu)化工作。在這里，您將確定您的目標(biāo)蛋白質(zhì)是否存在任何溶解度問(wèn)題，從而緩解其中**快樂(lè)的問(wèn)題，以及其純化的基本策略。然而，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模階段進(jìn)行的工作對(duì)于在探索性和大規(guī)模蛋白質(zhì)純化之間成功轉(zhuǎn)變**關(guān)重要。它使您能夠研究如何增加工作量，而不會(huì)影響產(chǎn)品回收率或純度。

通常，許多蛋白質(zhì)純化方案依賴于色譜的應(yīng)用，無(wú)論處理的體積如何。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模程序也不例外，這里的色譜過(guò)程可以分為三個(gè)主要階段：目標(biāo)蛋白質(zhì)捕獲，中間純化和**終拋光[1]。這些階段中的每一個(gè)階段在處理工作流程中執(zhí)行特定功能，因此在涉及流程設(shè)計(jì)時(shí)具有其自己獨(dú)特的一組要點(diǎn)。同樣，每個(gè)階段在擴(kuò)大規(guī)模期間都會(huì)遇到不同的挑戰(zhàn)。本文討論了開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模蛋白質(zhì)純化的下游工作流程時(shí)要考慮的重要因素，重點(diǎn)是色譜。

蛋白質(zhì)捕獲

蛋白質(zhì)捕獲的基本目標(biāo)是盡可能快地收集和保留盡可能多的目標(biāo)蛋白質(zhì)，同時(shí)讓不需要的雜質(zhì)不受阻礙地流過(guò)分離介質(zhì)。在此階段，您選擇的色譜樹(shù)脂的分辨性質(zhì)不如其對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合能力那么重要。

親和色譜樹(shù)脂通常用于蛋白質(zhì)純化的這個(gè)階段。它們是靶蛋白富集的有效方法，可快速將它們與任何可能損害它們的雜質(zhì)隔離。它們基于蛋白質(zhì)對(duì)基質(zhì)結(jié)合配體的吸引力而工作，并且這種相互作用可以由天然蛋白質(zhì)部分介導(dǎo)或通過(guò)工程添加親和標(biāo)簽。如果您的過(guò)程涉及外源標(biāo)簽，請(qǐng)仔細(xì)考慮如何在凈化過(guò)程結(jié)束時(shí)將其去除。首先詢問(wèn)您是否需要?jiǎng)h除標(biāo)簽; 通過(guò)蛋白酶處理去除標(biāo)簽可以為您的方案添加**少另**。如果這是**必須的，請(qǐng)記住在下游工作流程中構(gòu)建純化步驟，完全刪除標(biāo)簽，

如果您需要避免使用基于親和力的純化，因?yàn)槟Ｍ苊庠谀繕?biāo)蛋白質(zhì)中引入標(biāo)簽，離子交換層析樹(shù)脂可能是蛋白質(zhì)分離的另一種選擇。這些將在下面更詳細(xì)地討論。

無(wú)論您選擇哪種捕獲方法，請(qǐng)考慮此初始階段將處理**大的樣本輸入量; 因此，需要相對(duì)較快的流速來(lái)保持工作流程的效率。選擇具有良好流動(dòng)特性的較大珠粒樹(shù)脂（例如，非常親水的珠粒材料）以改善整體加工時(shí)間而不損害粘合能力。當(dāng)這個(gè)過(guò)程**終擴(kuò)展時(shí)，這對(duì)你有利。

中間凈化

在中間純化階段，目標(biāo)蛋白的分辨率是一個(gè)更重要的優(yōu)先事項(xiàng)。即使在上一步中已經(jīng)去除了大量雜質(zhì)，一些宿主細(xì)胞污染物仍會(huì)潛伏在樣品中。在這個(gè)階段，使用具有**佳珠粒尺寸的色譜樹(shù)脂可能是誘人的，因?yàn)橹榱３叽缗c**終產(chǎn)品分辨率相關(guān); 然而，中等尺寸的珠子通常更適合于該過(guò)程的這個(gè)階段。速度不太重要，因?yàn)槿魏螘?huì)影響靶蛋白穩(wěn)定性或活性的雜質(zhì)都會(huì)在捕獲步驟中被除去。但是，中等珠粒尺寸將在加工時(shí)間和純度之間提供**佳折衷，因?yàn)樗鼈內(nèi)匀辉试S去除異質(zhì)元素，例如電荷變體或截短蛋白質(zhì)。

離子交換色譜是中間階段純化的常用選擇。它根據(jù)電荷和相反電荷矩陣的吸引力捕獲蛋白質(zhì)。可以通過(guò)使用增加的離子強(qiáng)度或pH梯度或等度洗脫來(lái)進(jìn)行分離，其中流動(dòng)相保持不變但是基于極性促進(jìn)物質(zhì)通過(guò)基質(zhì)的更快或更慢的通過(guò)。這些蛋白質(zhì)分離的差異方法看到目標(biāo)蛋白質(zhì)在不同的洗脫窗口期間進(jìn)入流動(dòng)相，從而允許微調(diào)洗脫并進(jìn)一步濃縮目標(biāo)蛋白質(zhì)。

您還應(yīng)考慮在此中間階段使用混合模式樹(shù)脂。混合模式樹(shù)脂由于其組成而具有獨(dú)特的分離性能，其由多種分離方式組成。增加純化過(guò)程中使用的分離方法的數(shù)量和種類會(huì)產(chǎn)生更高質(zhì)量的**終產(chǎn)品。使用混合模式樹(shù)脂簡(jiǎn)化了這種策略，為各種生物分子提供了**的選擇性和分辨率。它還能夠在較高鹽濃度下加載樣品，具體取決于目標(biāo)蛋白質(zhì)和所用的混合模式樹(shù)脂。這消除了對(duì)離子交換色譜通常需要的緩沖液交換或透析步驟的需要，減少了總處理時(shí)間和樣品損失的可能性。

**終拋光

在色譜的**終拋光階段，主要目標(biāo)是通過(guò)去除痕量污染物來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的高分離度，并將其與任何不需要的結(jié)構(gòu)變體分離。對(duì)于**終的拋光色譜，也建議使用小珠粒尺寸。請(qǐng)注意，使用較小的珠粒尺寸會(huì)導(dǎo)致壓力增加; 在這種情況下，應(yīng)使用較低的流速，這意味著處理時(shí)間可以更長(zhǎng)。

尺寸排阻色譜（SEC）通常用于此目的，因?yàn)樗梢匀コ魏螕]之不去的雜質(zhì)，但也可以處理化學(xué)上相似但結(jié)構(gòu)上不合適的蛋白質(zhì)種類，例如目標(biāo)蛋白質(zhì)的二聚體或降解形式。顧名思義，它是一種非結(jié)合技術(shù)，根據(jù)蛋白質(zhì)的大小差異分離蛋白質(zhì)。使用等度緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)，如果您想獲得**佳分辨率，重要的是要考慮SEC基質(zhì)只能處理低樣品量負(fù)荷（平均≤矩陣體積的10％）。

**后一句話

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蛋白質(zhì)純化為未來(lái)的加工成功奠定了基礎(chǔ)，因此設(shè)計(jì)一個(gè)工作流程不僅可以產(chǎn)生**純凈的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，而且還可以保持未來(lái)的可擴(kuò)展性。考慮在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)中按照上述順序使用色譜樹(shù)脂。請(qǐng)記住，不同供應(yīng)商的每種介質(zhì)類別中都有各種樹(shù)脂，因此在設(shè)計(jì)過(guò)程中考慮每種樹(shù)脂的優(yōu)缺點(diǎn)也是有益的。有些更適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模流程的需求。